細胞培養是每個實驗人員的必備技能，俗話說：細胞養得好，實驗沒煩惱，然而事實卻是，實驗室的小細胞們經常容易“生病”，别人的培養基粉紅透亮，細胞長勢喜人，而自己在細胞培養中卻經常出現各種不明原因的渾濁和沉澱，這是什麼情況呢?

細胞培養時出現沉澱主要有2大原因：

一，細胞本身被污染;

二，培養基中有金屬、蛋白和其他培養基組分的沉澱;

首先，我們先來看看細胞污染。

1，細菌/真菌/酵母污染

細菌、真菌和酵母污染相對來說“道行尚淺”，是因為它們容易被肉眼和顯微鏡識别，如下圖：

在這三種污染重，細菌污染是三者之中個性較強的一位，有一定的辨别難度，常見的細菌有：杆狀菌、球狀菌和螺旋狀菌。

2，支原體污染

支原體可是細胞的天敵，這是因為支原體的平均直徑隻有 0.1~0.3 µm ，這在顯微鏡下都無法識别。

并且，由于支原體污染初期生長緩慢，更是沒有肉眼可以觀察到的現象。

檢測：常用的檢查方法為培養檢測法，即取1mL細胞培養液加入支原體液體培養基中，培養5天後，觀察培養基的顔色變化。如果變黃則懷疑該細胞受到支原體污染。如果不變色，則盲傳一代。

若顔色變黃，可接支原體固體培養基，于5%CO2培養箱中培養3～5天，觀察有無“煎蛋”狀支原體菌落。一旦發生污染即淘汰該細胞和培養液。

圖：支原體污染 (左側：電鏡照片(×30k); 右側：電鏡照片(×12k))

此外，支原體污染還可用熒光染色法和相差顯微鏡觀察法等檢測方法,或者直接購買支原體檢測試劑盒進行檢測。

處理措施：

●定期用支原體試劑盒檢測;

●換液可以減緩污染情況，但無法根除;

●支原體清除試劑盒可以達到較好效果;

●小鼠腹腔巨噬細胞清除法。

3，真核細胞污染

真核細胞污染是指一個細胞系中混入了其它細胞。由于各種細胞的外形大小差異甚微，這種污染同樣很難被識别。

一般碰到這種情況，隻能是将細胞丢棄了，因為這将對會對實驗結果可重複性産生重大的影響。

接下來，我們來看看培養基的問題。

如果排除了污染，細胞培養基中的渾濁通常被解釋為金屬、蛋白和其他培養基組分的沉澱，沉澱物可能損害細胞健康，因為他們通過螯合可移除養分和其他需要的組分，從而改變培養基的組成。

産生沉澱的可能原因及解決方案：

1，溫度變化

在細胞培養中，溫度是引起沉澱的主要因素之一。當遭遇溫度的極端變化時，高分子量血漿蛋白會從溶液中析出;

解決方案：

大家在培養細胞時一定要注意按照說沒事要求選擇最佳的培養基儲存和操作方法，并且要避免反複凍融。

2，失水誘導的濃度改變

如果培養基可能蒸發，培養基組分(包括鹽) 的濃度将會增加，特别是培養基表面可能容易形成

晶體沉澱。

解決方案：

●确保培養瓶/闆不經曆蒸發，監測孵育箱加濕效果;

●密封培養器皿避免脫水。

3，鈣鹽

制備無血清培養基時，組分添加的順序可能導緻不可溶分子的形成。鈣鹽尤其容易沉澱，比如CaCl2和MgSO4在溶液中反應産生CaSO4晶體。高壓滅菌和pH值不穩定會加劇這一問題。

解決方案：

●逐個添加其它培養基組分之前，用去水離子水單獨溶解CaCl2

●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

4，金屬補充物

銅、鐵和鋅等金屬離子是細胞生長所必需的，是無血清培養基的重要補充物。

培養系統中其他血清組分的缺失可能導緻這些金屬沉澱，為細胞形成有毒的環境。

在較高pH環境下(一般>8時)，碳酸鹽和氫氧根離子與銅離子、磷酸鹽和氫氧根離子與鐵離子、碳酸鹽、磷酸鹽和氫氧根離子與鋅離子、氫氧根離子與鎂離子易形成不溶性沉澱物;

在氧化條件下，銅和鋅更易于沉澱。

金屬沉澱物對照顔色表

解決方案：

●鐵結合蛋白轉鐵蛋白的加入可防止鐵在培養中沉澱;

●可添加緩沖液避免滲透壓的變化。

●向培養基中補充甘露醇或丙酮酸以結合過氧化氫，盡可能降低氧化應激。

學會對各種污染情況的辨别和處理是一項不可或缺的實驗技能，希望大家在看完我們的文章後結合你的實驗操作，學會如何應對細胞污染。

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