衆所周知，對于具有多個表位的抗原而言，雙夾心 ELISA（Double Sandwich ELISA）可應用于目标抗原或抗體的定量檢測。而對于小分子抗原或半抗原，因缺 乏可作夾心法的兩個以上的結合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定。此時， 可以采用競争抑制法模式來檢測其中靶分子的含量。競争抑制 ELISA 又叫封閉 ELISA，其主要原理是将标本中的抗原和一定量的酶标抗原競争與固相抗體結合。 标本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶标抗原愈少，最後的顯色也愈淺，也就 是說，最終顯色的結果與待檢抗原或抗體的幹擾程度成負相關。小分子激素、藥物 等 ELISA 測定多用此法。

對于很多習慣了雙夾心法ELISA檢測的實驗人員而言，在面對競争抑制ELISA 數據時常常會遇到不知如何分析的問題，上次我們已就經典的雙夾心 ELISA 标準 曲線的繪制和拟合進行了詳細講解（雙夾心法标準曲線的拟合方法），因此，接下 來我們将以 Cloud. Clone 公司的 CEA924Ge，氰钴胺素(CNCbl)檢測試劑盒的一次 質檢标準品吸光度值為例，詳細地介紹一下用 EXCEL 軟件進行競争抑制 ELISA 标 準曲線的拟合步驟。

如圖 1 所示，實驗人員從最高 10000 pg/mL 濃度的标準品（第 F1 孔），經倍 比稀釋至 123.5 pg/mL 濃度（第 B1 孔），陰性對照孔為單獨的标準品稀釋液（第 A1 孔），可以看出對于競争抑制 ELISA 法來說，一般而言陰性對照孔的吸光度值 最大。

與雙夾心法 ELISA 不同的是，競争抑制 ELISA 的标準品吸光度值并不需要減 去陰性對照孔的本底吸光度值。以标準品的各孔吸光度值為 x 軸，标準品相應濃度 取 Log10 後的值(如圖 2 所示的綠色突出顯示部分)為 y 軸作 XY 散點圖，得到一條 5 點曲線，其中 X 軸為吸光度（Optical Density），Y 軸為濃度的對數值（Log. of Concentration），如圖 3 所示。

接着，在該曲線中任選一點以右鍵打開，選擇”添加趨勢線(R)”，圖表上便 會彈出一個對話框。在“類型”選項中選擇“多項式(P)”并将“階數(P)”設定為 2 階。最後，在“選項”中勾選“顯示公式(E)”和“顯示 R 平方值(R)”（如圖 4 及圖 5 所示），點确定，便會出現标準曲線的對應公式及 R2 值（如圖 6 所示）。

圖 3 标準曲線示例圖

圖 4. 添加拟合公式的過程示意圖

圖 5 典型帶拟合公式的标準曲線示意圖

在了解了競争抑制 ELISA 标準曲線的繪制方法之後，我們如何判斷一條标準 曲線是否良好呢？一般而言，合格的競争抑制 ELISA 标準曲線應具備以下三點：

1. 标準品濃度越高，則得到的吸光度值越低，即樣品中分析物濃度與吸光度 呈負相關；

2. R2值應至少大于 0.95，并且越接近 1 越好；

3. 陰性對照孔的吸光度值應大于 0.8。

接下來，我們将繪制和分析競争抑制 ELISA 标準曲線過程中常見的問題及相 應的解決方案總結如下：

表 1. 競争抑制 ELISA 标準曲線的常見問題及解決方案

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