在分析工作中，為了使測量結果有較高的靈敏度和準确度，必須選擇合适的實驗條件，對分析條件進行優化。紫外-可見分光光度法的分析條件主要是指儀器測量條件、顯色反應條件以及參比溶液的選擇。

一、儀器測量條件的選擇

1.測量波長 根據待測組分的吸收光譜，通常選擇有最大吸收強度的吸收峰所對應的最大吸收波長λmax作為測量波長。因為在λmax處待測組分每單位濃度所改變的吸收光度最大，從而使得到的光譜具有很好的靈敏度；且在λmax處吸光度随波長的變化最小，從而使測量具有較高的準确度。但如果λmax處吸收峰太尖銳，則在滿足分析靈敏度的前提下，選擇次一級的吸收強度的吸收峰或肩峰對應波長作為測量波長。

2. 儀器狹縫寬度 狹縫的寬度直接影響測量的靈敏度和标準曲線的線性關系。狹縫寬度過寬時，通過樣品溶液的光的強度增加，同時可能引入其他波長的單色光從而使測量的靈敏度降低，以緻偏離朗伯-比爾定律。但若狹縫寬度過窄，光的強度變弱，測量的靈敏度也可能降低。通常在不減少吸光度時的最大狹縫寬度為适宜的狹縫寬。

3. 吸光度的範圍 吸光度（A）在0.2~0.8時，實驗偶然變動因素（光源的穩定性、測量環境改變等）對測量結果的影響較小，相對誤差較小，所以在測量時，通常選擇吸光度的測量範圍在0.2~0.8。若超出該範圍，可通過調整待測液的濃度和吸收池的厚度等方法進行調節。

二、顯色條件的選擇

分光光度法的許多分析都是建立在比色分析基礎上的。如果待測組分本身沒有顔色或本身顔色很淺，那麼就無法直接進行測定，需利用顯色反應将待測組分轉變為有色物質，然後進行測定。這種将試樣中待測組分轉變成有色化合物的化學反應，稱為顯色反應。與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。在分光光度分析中，顯色劑的選擇及顯色條件的控制極為重要。

（一）顯色反應的要求

常用的顯色反應是形成螯合物的反應，有時也采用形成簡單配合物的反應和氧化還原反應。同一被測組分往往可與多種顯色劑反應，生成不同有色物質，其原理和靈敏度亦有差别。在分析時，究竟選用何種顯色反應較适宜，應考慮以下四個因素：

1. 顯色反應靈敏度高 分光光度法一般用于微量組分的測定，要求顯色劑與待測組分之間的顯色反應具有很好的靈敏度，應選擇顯色反應産物的摩爾吸光系數ε較大的反應。

2.顯色劑選擇性好 顯色劑隻與待測組分發生顯色反應，而與溶液中的共存組分不發生反應，這樣儀器測量的數據才有很好的準确度。

3.顯色劑的對照性要高 顯色劑在測定波長處應無明顯吸收，如果顯色劑有色，則要求顯色劑與顯色反應産物的顔色差别要大，以減小試劑的空白值，提高測定的準确度。一般要求顯色反應産物與顯色劑的最大吸收波長之差應大于60nm。

4.顯色反應産物穩定 要求待測組分與顯色劑的反應産物有很好的穩定性，不易受空氣、光等因素的影響。在測定過程中吸光度保持不變。

（二）顯色條件的選擇

1.顯色劑用量 取決于形成有色化合物的組成。顯色劑用量太少或太多均會引起對朗伯-比爾定律的偏離。為了保證顯色反應盡可能完全，減少有色化合物的解離并使其保持恒定，一般需要加入适當過量的顯色劑。顯色劑的适宜用量可通過實驗确定：在一系列相同待測組分溶液中加入不同濃度的顯色劑，測定溶液的吸光度随顯色劑的濃度變化曲線，在吸光度随顯色劑濃度變化不大的範圍内，确定顯色劑的加入量。

2.溶液pH 多數顯色劑是有機弱酸或弱堿，溶液的pH直接影響顯色劑的解離程度，從而影響顯色反應的完全程度。選擇合适的pH是顯色反應最基本的實驗條件。溶液酸度對顯色反應的影響是多方面的，如影響顯色劑的平衡濃度和顔色變化、有機弱酸類的配位劑的存在形式、待測組分與配位劑形成的配合物的穩定性等。顯色反應的最适宜酸度範圍可以通過實驗來确定：在待測組分濃度和顯色劑濃度一定的情況下，測定吸光度随溶液pH變化曲線，吸光度恒定或變化較小時所對應的pH範圍即為顯色反應的最适宜的pH範圍。

3.顯色反應的時間和溫度 有些顯色反應瞬間完成，而且顔色穩定，在較長的時間内變化不大。但有些顯色反應速度較慢，溶液顔色需要經過一段時間才能穩定，而且經過一段時間後，由于氧化、光照、試劑揮發等因素使顔色減退。實際工作中，确定适宜顯色時間的方法是配制一份顯色溶液，從加入顯色劑開始，每隔一定時間測吸光度一次，繪制吸光度時間關系曲線。曲線平坦部分對應的時間就是測定吸光度的最适宜時間。顯色反應通常在室溫下進行，但對于反應速率較慢的反應體系，則需要改變反應條件，如對體系加熱，從而加快反應速率。顯色反應最适宜的溫度也是通過實驗确定的。

三、參比溶液

在吸光度測量中，先要用參比溶液調節透光率，設定通過參比溶液的透光率為100%，以消除吸收池壁及溶劑對入射光的反射和吸收帶來的誤差。選擇适宜的參比溶液對提高測定的準确度具有重要作用。如果參比溶液選擇不當，常會引起校正曲線不過坐标原點或不成線性關系，因此分析測定時應視具體情況選擇合适的參比溶液。

1.溶劑參比溶液 當樣品組成較簡單，共存的其他組分和顯色劑在測定波長處無吸收時，可用純溶劑（如蒸餾水）作為參比溶液，這樣可消除吸收池、溶劑等因素的影響。

2.試劑參比溶液 如果顯色劑在測定波長處有吸收時，則測量時應消除顯色劑對測量的影響，此時應用空白溶液作為參比溶液，即按顯色反應相同的條件，在溶劑中加入與樣品溶液中相同含量的顯色劑作為參比溶液。

3.樣品參比溶液 如果樣品溶液組分較複雜，其他共存離子在測定波長下有吸收但不與顯色劑反應，當顯色劑無吸收時，可用不加顯色劑的被測試樣溶液作為參比溶液。

4.平行操作參比溶液 若顯色劑、待測溶液中各組分均在測定波長下有吸收，則可用不含被測組分的試樣，在相同條件下與被測試樣同時進行處理，測定時以前者所得的溶液為參比溶液，稱為平行操作參比溶液。臨床上進行某種血藥濃度的監測時，可取正常人血樣和待測血藥濃度的血樣在相同條件下處理，用正常人血樣得到的溶液作為參比溶液。

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